HPLC分析纯化合成多肽的方法分享

　　HPLC分析纯化合成多肽的方法分享
 

　　分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
 

　　HPLC分两类:离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。
 

　　分离是一种电荷相互作用，通过可变PH， 离子强度， 或两者洗脱出多肽，通常， 先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
 

　　反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱， 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。
 

　　由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的， 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而，总体实践中， 这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成， 比如苯基。
 

　　典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)
 

　　大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高pH，甚至微碱pH， 因为这样会破坏柱子。
 

　　不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%， 而肽含量相关带电基团(如Arg, Lys )的抗离子量和肽亲水性决定。这是合成肽的本身特性。