了解一下合成多肽分析鉴定方法有哪些吧

　　今天让我们一起来了解一下合成多肽分析鉴定方法有哪些吧
 

　　多肽的分析鉴定方法有多肽一级结构，二级结构鉴定，多肽一级结构包括：质谱分析，氨基酸组成分析，氨基酸序列分析。二级结构包括：圆二色谱(CD)，NMR，X-衍射等方法。
 

　　一、纯度分析
 

　　多肽的纯度分析，一般都采用HPLC进行分析，选择RP-C18，粒径5μm，孔径300A，4.6×150mm，流动相：A，0.1% TFA/H2O;B，0.1% TFA/ACN，洗脱梯度，5%B--65%B，时间30min。也有些多肽，特别是短肽，由于亲水性强，在C18上保留很弱，需要改变条件，这里主要有两种方法：一个改变分析梯度，可以将起始梯度改为2%，等度或小梯度洗脱;另外一个方法是在流动相中加入强离子对试剂，如七氟丁酸，十八烷基磺酸钠等。
 

　　二、一级结构分析
 

　　1.质谱分析
 

　　质谱分析的目的主要是确证分子量，当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是这个需要比较全的数据库作为基础，分析才能比较准确。由于多肽性质不稳定，需要采用软电离技术，目前多肽分析主要使用了电喷雾(ESI-MS)，基质辅助激光解吸(MALDI-MS)。
 

　　其中ESI-MS通常会给出多电荷峰，电荷数目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的数目有关，因此，经常给出了双电荷，三电荷等离子峰。
 

　　MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情况下很少带多电荷，因此数据直接对应了分子离子峰，容易分析。此外，通常在分析长肽或蛋白过程中，需要添加NH4，Na，K等离子，提高灵敏度，所以一般在MS中出现一组峰，分别对应：(M+H)+，(M+NH4)+，(M+Na)+，(M+K)+。
 

　　2.氨基酸组成分析
 

　　氨基酸组成分析一般需要产品的纯度较高，它可以给出多肽中氨基酸的种类，数目。分析过程首先通过酸水解破坏肽键，典型酸水解的条件是：真空条件下，110℃，用6M盐酸水解16至72小时。
 

　　酸水解虽然很有用，但酸水解条件下不能获得完整的氨基酸分析，因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键，用于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸，谷氨酰胺转换为谷氨酸。由于水解温度比较高，色氨酸的吲哚环容易被空气氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。
 

　　因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估计的，也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能准确测定，要准确测量需要在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
 

　　3.氨基酸序列分析
 

　　氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。
 

　　然后PTC-肽用处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂(例如氯丁烷)从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。
 

　　萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行