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了解一下合成多肽分析鉴定方法有哪些吧
点击次数:13 发布时间:2021-01-04
  今天让我们一起来了解一下合成多肽分析鉴定方法有哪些吧
 
  多肽的分析鉴定方法有多肽一级结构,二级结构鉴定,多肽一级结构包括:质谱分析,氨基酸组成分析,氨基酸序列分析。二级结构包括:圆二色谱(CD),NMR,X-衍射等方法。
 
  一、纯度分析
 
  多肽的纯度分析,一般都采用HPLC进行分析,选择RP-C18,粒径5μm,孔径300A,4.6×150mm,流动相:A,0.1% TFA/H2O;B,0.1% TFA/ACN,洗脱梯度,5%B--65%B,时间30min。也有些多肽,特别是短肽,由于亲水性强,在C18上保留很弱,需要改变条件,这里主要有两种方法:一个改变分析梯度,可以将起始梯度改为2%,等度或小梯度洗脱;另外一个方法是在流动相中加入强离子对试剂,如七氟丁酸,十八烷基磺酸钠等。
 
  二、一级结构分析
 
  1.质谱分析
 
  质谱分析的目的主要是确证分子量,当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,但是这个需要比较全的数据库作为基础,分析才能比较准确。由于多肽性质不稳定,需要采用软电离技术,目前多肽分析主要使用了电喷雾(ESI-MS),基质辅助激光解吸(MALDI-MS)。
 
  其中ESI-MS通常会给出多电荷峰,电荷数目和多肽序列上氨基,胍基,咪唑基的数目有关,因此,经常给出了双电荷,三电荷等离子峰。
 
  MALDI-MS可以分析蛋白大分子,而且通常情况下很少带多电荷,因此数据直接对应了分子离子峰,容易分析。此外,通常在分析长肽或蛋白过程中,需要添加NH4,Na,K等离子,提高灵敏度,所以一般在MS中出现一组峰,分别对应:(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。
 
  2.氨基酸组成分析
 
  氨基酸组成分析一般需要产品的纯度较高,它可以给出多肽中氨基酸的种类,数目。分析过程首先通过酸水解破坏肽键,典型酸水解的条件是:真空条件下,110℃,用6M盐酸水解16至72小时。
 
  酸水解虽然很有用,但酸水解条件下不能获得完整的氨基酸分析,因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键,用于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸,谷氨酰胺转换为谷氨酸。由于水解温度比较高,色氨酸的吲哚环容易被空气氧化,即使在密封的管中,色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。
 
  因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估计的,也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能准确测定,要准确测量需要在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化,形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
 
  3.氨基酸序列分析
 
  氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解,主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理,PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。
 
  然后PTC-肽用处理,N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断,释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂(例如氯丁烷)从反应液中萃取出来,而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。
 
  萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定,经酸作用,再进一步环化,形成一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程,整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行
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